一、收到原代培養(yǎng)的細(xì)胞后應(yīng)該有哪些注意事項？

顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，看是否有細(xì)胞脫落、漏液和污染等異常情況，然后仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書，因不同品牌、不同種屬、不同類型的細(xì)胞其培養(yǎng)技巧存在些許差別，戶收到細(xì)胞后，請務(wù)必仔細(xì)閱讀隨貨附贈的說明書，切記不可僅憑經(jīng)驗操作。

通常，我們可以從說明書中獲取以下重要信息：

（1）細(xì)胞數(shù)目

（2）細(xì)胞增殖能力

（3）推薦培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿及包被液

（4）推薦接種密度

（5）復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代等操作步驟

（6）運輸、儲存及培養(yǎng)條件

二、細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

收貨處理

1. 貼壁細(xì)胞

發(fā)貨形式：T25方瓶、凍存管

1. 1) 收到T25方瓶細(xì)胞后，拆開T25方瓶的自封袋，不拆封口膜，表面噴75%酒精后請在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)（可以拍下此時細(xì)胞照片）。去掉封口膜并將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱中約2-3h，然后再處理細(xì)胞。首先將T25方瓶中的培養(yǎng)基取出裝在兩個50ml離心管中備用，然后消化傳代。檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們（凍存管細(xì)胞收到后直接37℃水浴復(fù)蘇或直接放置于液氮中長期儲存）。

2. 2) 凍存管細(xì)胞，收到細(xì)胞后按照細(xì)胞復(fù)蘇的步驟操作即可。

2、懸浮細(xì)胞

收到細(xì)胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將細(xì)胞置于中37培養(yǎng)箱℃平衡約2-3h。然后，1200rpm離心5min，棄去15ml離心管中的培養(yǎng)基，細(xì)胞沉淀用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸并培養(yǎng)。

細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代

1、細(xì)胞培養(yǎng)

正確的培養(yǎng)基90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清10%。

培養(yǎng)條件： 溫度37℃，CO2，5%。，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。極少部分細(xì)胞培養(yǎng)條件不一致，請仔細(xì)閱讀對應(yīng)的細(xì)胞說明書，使用正確的培養(yǎng)方式。

凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2、細(xì)胞傳代

如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代。

1.  貼壁細(xì)胞的傳代

（1） 棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS浸洗皿/瓶底所有部位的細(xì)胞1-2次。

（2） 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，置于37℃培養(yǎng)箱中消化2-3分鐘。

（3） 2-3分鐘后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。若細(xì)胞仍在貼壁，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化至細(xì)胞大部分變圓脫落為止。

（4） 輕輕吹打培養(yǎng)瓶底，然后將瓶中的培養(yǎng)基吸出，移入15ml離心管中，在1200RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。

（5） 均分到幾個到事先準(zhǔn)備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存

細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法的1-4步驟進(jìn)行，最后的重懸液使用血清。懸浮細(xì)胞直接計數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。本公司按每個凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個細(xì)胞凍存。

細(xì)胞復(fù)蘇：

1）將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍融化。

2）移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

3）將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

三、原代細(xì)胞的傳代周期和傳代次數(shù)怎樣確定？

原代細(xì)胞一般是采用“倍增次數(shù)”來描述細(xì)胞生長潛能的，一次細(xì)胞倍增是指細(xì)胞總數(shù)增長為原來的2倍，一次傳代通常是指將一瓶細(xì)胞擴(kuò)增至2-3瓶。由于不同物種、組織來源、細(xì)胞類型和體外培養(yǎng)條件等因素的影響，原代細(xì)胞“倍增次數(shù)”可能會有很大差異，所以對某些原代細(xì)胞的傳代周期和傳代次數(shù)需進(jìn)行具體分析。

四、欣潤生物的原代細(xì)胞，是否需要特定的包被液包被培養(yǎng)瓶/皿？

欣潤生物的大多數(shù)細(xì)胞可以在不使用包被液的情況下自行貼壁。然而仍有部分細(xì)胞類型需要使用指定的包被材料。具體情況請參見說明書中相應(yīng)部分的內(nèi)容。

五、如何計算大鼠胰島的IEQ值？

一般情況下,直徑大小為150um 的胰島細(xì)胞 = 1 IEQ.

胰島 IEQ 對照表：

顯微鏡下記錄細(xì)胞大小和數(shù)量后，請按以上對照表計算，再乘以稀釋倍數(shù)就是總的IEQ值。

例如：您從3ml細(xì)胞懸液中取出50ul，觀察計數(shù)后得出：

        50-100 um 有5個胰島

        101-150 um 有3個胰島

        151-200 um 有2個胰島

        201-250 um 有4個胰島

那么總的IEQ值=60×（0.17×5+0.67×3+1.7×2+3.5×4）=1215.6 IEQ